本发明公开了一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品结合垫上包埋有荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体，硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有二甲戊灵半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，二甲戊灵单克隆抗体是以二甲戊灵半抗原‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，二甲戊灵半抗原是由3‑(1‑乙基丙氨)‑6‑甲基‑2,4‑二硝基苯甲醛与3‑肼基丙酸反应得到。本发明还提供了该试纸条的制备方法和应用该试纸条检测二甲戊灵残留的方法。本发明的试纸条具有灵敏度高、检测快速、操作方便、经济实用等优点。