本发明公开了一种分子标记多态性鉴定用聚丙烯酰胺凝胶制备方法，包括一下步骤：1)26％聚丙烯酰胺母液制备及贮存；2)1.5M的Tris‑HCl(pH 8.8)配制及贮存；3)10％g/ml的APS的配制及贮存；4)聚丙烯酰胺凝胶工作液制备及贮存；5)使用前在聚丙烯酰胺凝胶工作液中加入10％APS和TEMED得到混合物，所述聚丙烯酰胺凝胶工作液、10％APS以及TEMED的比例为30ml：200μL：50μL；6)进行电泳。本发明工艺简单、效率高，聚丙烯酰胺凝胶稳定性高，工作液能够长时间储存，将会大大节省药品成本，提高制胶效率，极大地确保分子标记鉴定的简易型和稳定性，为分子标记的多态性鉴定提供保障；同时利用本发明能够提高实验的精度和准确性，降低实验成本和实验人员工作量。