本发明公开了一种用离子交换树脂分离L‑草铵膦和葡萄糖酸的方法，该方法包括：取含L‑草铵膦和葡萄糖酸的L‑草铵膦粗液，调节粗液的pH值至1～4，得到进料液；将进料液加入至装有强酸型阳离子交换树脂的交换柱中，进行色谱分离，收集含葡萄糖酸的流出液；在交换柱底部检测到L‑草铵膦的浓度达到进料液中L‑草铵膦浓度的5～10％时，停止加入进料液；然后，先用去离子水洗涤树脂，再用碱液作洗脱剂解吸L‑草铵膦，收集洗脱液，得到L‑草铵膦溶液。本发明先调节L‑草铵膦粗液的pH值，再利用强酸型阳离子交换树脂进行色谱分离，实现了L‑草铵膦和葡萄糖酸的高效分离，分离效率高。