本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101外源插入片段旁侧序列及其应用。本发明提供的转基因玉米CM8101经Southern blot鉴定有一个插入位点，这个插入位点的外源插入片段的5’端和3’端旁侧序列如SEQ ID No.1、2所示。本发明提供了用于检测该旁侧序列的引物对，分别如SEQ ID No.3‑4和SEQ ID No.5‑6所示的核苷酸序列。本发明的转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于对转基因玉米CM8101包括亲本、杂种F1和后代，及其植株、组织、种子及其制品的检测。