本发明涉及一种生物碱类物质的在线富集与分析方法，包括以下步骤：A、使第一流动相携带样品经过弱阳离子吸附柱，将样品中的生物碱类物质和中性物质吸附在该柱内，其余组分随第一流动相排出；B、改用第二流动相流过该吸附柱所吸附的中性物质被洗脱而随该第二流动相排出并丢弃，生物碱类物质仍保留在该吸附柱内；C、改用第三流动相流过该吸附柱，将所述生物碱类物质洗脱并用稀释相稀释后进入第一收集柱内，其中生物碱类物质被吸附在该第一收集柱内，第三流动相则排出，如此积累直至该第一收集柱内吸附有足够的生物碱类物质；D、改向所述第一收集柱内供应第四流动相，将所积累的生物碱类物质洗脱出来，并随第四流动相进入分析色谱柱进行分析。