本发明涉及基因工程及代谢工程领域，公开了基因工程及代谢工程领域，具体地，涉及一种重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用。本发明的重组酿酒酵母菌株包括能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒：(1)来自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的araA基因，(2)来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araB基因，(3)来自植物乳杆菌的araD基因。本发明的重组酿酒酵母菌株具有外源整入的阿拉伯糖作为碳源的代谢途径，在木质纤维素原料发酵制备生物液体燃料乙醇工艺中，既可利用葡萄糖亦可利用阿拉伯糖，可实现木质纤维素原料93.2％的糖醇转化率，且菌株发酵性能良好，提高吨原料的乙醇产率，提高原料利用率，适合于纤维素乙醇的大规模生产。