本发明提供了一种确定鱼类对水力因子偏好区间的试验水槽及试验方法，试验水槽包括上端消能池、中间试验段、下端适应区、水输送管道；所述上端消能池、中间试验段、下端适应区、水输送管道依次连通固定成循环通道，中间试验段的侧壁上有多块阻流体将中间试验段内的通道空间分割为多级相间隔的池室和竖缝；中间试验段中水流方向为从上端消能池至下端适应区。本发明不但双重保证了结果数据的可靠性还考虑了池室本身水力因子分布不均匀的影响，确保得到的鱼类对水力因子偏好区间更加准确；除了提供鱼类水力因子偏好区间确定方法，还提供了鱼类水力因子偏好区间数据在过鱼设施池室结构和进口布置等方面的应用。