本发明涉及一种检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法与应用，属于免疫学技术领域和食品安全分析技术领域。该酶联免疫试剂盒含有包被有捕获抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测抗体、牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液。所述捕获抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2018217的杂交瘤细胞株skTnI‑3A8分泌得到，所述检测抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2018218的杂交瘤细胞株skTnI‑3D3分泌得到。该酶联免疫试剂盒具有灵敏度、精密度、准确度高，交叉反应率低，适合大批量样品检测等优点。