本发明公开了一种单个疾病样本通路激活度的评估方法及相似疾病区分方法；对每条通路构建全连通网络，并将通路中原有的连边作为其重要连边，添加的连边作为其背景连边；将通路中存在的基因作为重要基因，其他基因作为背景基因；对全连通网络中的每条连边，计算疾病样本和正常样本的差异值，并计算差异值显著性；计算每个基因在疾病样本与正常样本中表达值的差异倍数；计算在每个全连通网络的节点和连边排名中重要节点和连边的富集程度，作为相应通路的激活度。以通路的激活度为特征区分相似疾病。本发明能有效计算单个疾病样本中每条通路的激活度，将疾病样本高维、小样本的基因表达矩阵转换成通路激活度的表达矩阵，用于区分相似疾病，准确度高。