本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种用于生产桧烯的重组载体及重组酵母菌株及其构建方法和应用。本发明所述重组质粒包含编码F96W和N127W双重突变的ERG20的序列ERG20ww，以及来源于Salvia pomifera和/或Citrus jambhiri的桧烯合酶编码序列。本发明选择合适的双重突变的ERG20的序列ERG20ww以及外源桧烯合酶基因进行搭配组合，构建出能够生产桧烯的重组载体并利用该载体转化到酵母菌株中，可显著提高菌株生产桧烯的能力，在此基础上继续优化改造，可进一步提高菌株生产桧烯的产量。