一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，先对提取的DNA进行含量的鉴定；再分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域，借助实时荧光定量PCR MGB探针法分别对性别位点A和B进行扩增和鉴定；本发明设定两种性别扩增基因相结合，两种性别基因鉴定结果可以互相补充和验证，大大增加了古代人类遗骸性别鉴定结果的可靠性；本发明方法所用的古DNA模板量较少，只要1.5μl就可以完成模板定量两种性别基因鉴定整个过程；实时荧光定量PCR技术的应用，相对于传统PCR扩增和凝胶电泳验证步骤，缩短了实验时间和减少了操作步骤，提高了检测灵敏性和效率。