本发明公开透明纸基紫外-可见光吸收测定装置，包括蛋白质检测层A、胆固醇检测层B、样品、紫外-可见分光光度计，所述蛋白质检测层A与所述胆固醇检测层B分别设置于所述紫外-可见分光光度计的输出端，所述样品分别被加入到所述蛋白质检测层A和所述胆固醇检测层B干燥后堆叠，然后通过所述紫外-可见分光光度计射出光束到所述样品上实现对蛋白质和胆固醇的同时检测。本发明还公开透明纸基紫外-可见光吸收测定装置的分析方法可以实现对蛋白质和胆固醇的同时检测，并且对蛋白质和胆固醇的检测都具有高灵敏度和良好的选择性，其检测限分别为0.09 mM和0.075μM。