本发明公开了一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法及使用方法，收集临床肿瘤手术样本或PDX小鼠肿瘤样本，单细胞悬液制备，肿瘤干细胞和巨噬细胞提取，3D共培养装置的建立，LDH检测肿瘤干细胞活力，根据对照组肿瘤干细胞的活力值，计算出给药组肿瘤干细胞活力增殖百分比，进而评价相应药物的药效，由于肿瘤干细胞在体外不容易生长，此种方法先筛选出具有高度增殖能力的肿瘤干细胞，再借助其成瘤，两周即可做出药效结果。可以结合体内和体外实验技术进行快速抗肿瘤药物药效评价，可用于快速高效的检测抗肿瘤药物的药效。