本发明公开了固定化酶催化法制备D‑核酮糖，该方法先扩增、发酵生产D‑核酮糖代谢途径中所需的系列酶，接着对酶做纯化和固定，再加入起始原料，合成D‑核酮糖。本发明方法采用系列酶连续地将D‑葡萄糖酸转化成2‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸、3‑氧‑D‑葡萄糖酸‑6‑磷酸以及D‑核酮糖‑5‑磷酸，比较完全地将D‑葡萄糖酸一步转化成最终产物。并通过在反应体系引入乳酸脱氢酶与丙酮酸，ATP再生酶与多聚磷酸，则能循环再生辅酶，从而有效降低这些昂贵的辅酶的用量。