本发明提供了一种双光子显微成像系统，所述双光子显微成像系统包括激光器、二次谐波产生装置及双光子显微成像装置，所述二次谐波产生装置位于所述激光器与所述双光子显微成像装置之间；所述二次谐波产生装置用于对所述激光器发出的激光的频率进行倍增，所述二次谐波产生装置包括依次设置于所述激光器的出射光路上的相位延迟片、非线性介质。本发明通过非线性介质对所述激光器发出的激光的频率进行倍增，大大简化了整个系统的结构、降低了整个系统的成本，且非线性介质受环境干扰较小，从而提升了整个系统的稳定性。此外，本发明不需要采用结构复杂且价格昂贵的锁模钛蓝宝石激光器作为泵浦光源，进一步降低了成本。