本发明公开了松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒。本发明以松材线虫的Bx‑tlp‑1基因为靶标设计了多对引物，经过筛选发现SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对扩增松材线虫和拟松材线虫DNA，结果松材线虫有特异性片段，该片段大小为755bp，而拟松材线虫无特异性片段；本发明进一步利用该特异性引物对扩增野外采集的媒介天牛组织DNA，结果扩增出松材线虫的特异性片段。本发明所筛选出的PCR特异性引物对具有良好的特异性和灵敏度，能够准确的检测媒介天牛是否携带松材线虫，并在野外对媒介天牛实现快速检测。