本发明涉及一种基于G‑四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，属于生化分析领域。首先，以含G‑四链体序列、经不同甲基化修饰的Hairpin DNA为底物，加入BstUI，于60℃反应，含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物不能被识别，从而不能被剪切，而不含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物能被剪切，释放出G‑四链体片段；最后，向体系中加入N‑甲基卟啉二丙酸IX，与G‑四链体结合产生强荧光信号，可根据荧光信号的强弱鉴别BstUI的甲基化敏感位点。此外，也可通过凝胶电泳对反应后的DNA进行表征以判断甲基化敏感位点。本方法提供了两种灵活的鉴别方式，并鉴别了新的BstUI的甲基化敏感位点。