本发明涉及一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，属于分子育种技术领域，首先针对西瓜的Clpsk1基因的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，然后构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32‑CAS9‑gRNA‑Clpsk1载体；利用农杆菌介导法将基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；对转化植株进行Clpsk1基因编辑检测和枯萎病抗性鉴定，所得阳性植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。本发明方法可快速高效地获得西瓜抗病新种质，极大地缩短了育种周期，提高了育种效率，获得的材料不含有任何外源基因，除提高了西瓜抗枯萎病的能力，其他农艺性状不受影响。