本发明公开了快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的HRM引物、试剂盒及方法。本发明首先基于瓜实蝇和南亚果实蝇线粒体基因组设计合成用于区分两种实蝇的HRM特异性引物，分别提取瓜实蝇和南亚果实蝇基因组DNA，然后以提取的DNA为模板，EvGreen为染料进行高分辨率实时荧光定量PCR分析，根据熔解温度曲线峰值差异区分两种实蝇种类。本发明解决了两种共寄主发生且幼虫相似的瓜实蝇和南亚果实蝇快速鉴定的问题，建立了基于线粒体基因鉴别两种实蝇的HRM方法。本发明可快速、高效、简捷区分在瓜类蔬菜上混合发生的瓜实蝇和南亚果实蝇，准确性高，能实现高通量，重复性好且成本低廉。