本发明属于生物素中间体含量检测技术领域，具体涉及一种生物素合成中的过程中间体双氨基物的HPLC检测方法。该方法包括如下步骤：用流动相溶解生物素合成过程中的环合反应液后在以下色谱条件下进行检测：色谱柱C18-WCX混合柱；检测波长为195-220nm，测试时间为16-20min，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液。本发明提供的检测方法可以在使待测物质双氨基物的出峰时间稳定在10-12min，解决了双氨基物与溶剂峰出峰重合的问题，使得监测更加准确、可靠。