本发明属于微生物驱油技术领域，具体涉及到一种内源微生物驱油分层激活提高采收率的方法，具体包括以下步骤：试验井组的筛选；试验井组油层激活顺序的确定；试验井组油层激活剂注入体积及注入速度的确定；试验井组油层培养时间的确定；现场实施及效果评价。本发明具有方法合理、工艺简单、操作简易、安全可靠，投入少、成本低的特点。同时，针对油层不同物性特点实施内源微生物激活，在保证各油层激活剂有效浓度的同时也能保证激活剂在油层中滞留足够时间从而充分激活该层的内源微生物，现场试验提高采收率大于15％。因此，有利于现场推广应用。