本发明公开了一种竹叶黄酮的分离纯化方法，包括：将竹叶黄酮浸膏或流膏醇溶或稀释、醇沉、离心；取离心液拌聚酰胺上柱层析，以水-醇体系梯度洗脱获得a组洗脱液，检测a组各洗脱液中黄酮总含量，其最低值为b；选取b含量黄酮上硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-醇体系梯度洗脱获c组洗脱液，检测c组各洗脱液中黄酮含量，其最低值为d；以及选取d含量黄酮，二次上硅胶或聚酰胺柱层析，获得e组洗脱液，检测e组各洗脱液中黄酮总含量，其最低值为f；采用Al(N03)3、NaNO2和NaOH显色、紫外光谱法检测总黄酮含量。本发明方法适于工业化生产。