本发明提供了基于血清的布鲁氏菌疫苗株感染与野毒株感染快速鉴别方法。本发明根据布鲁氏菌疫苗株感染人血清和野毒株感染人血清的质谱数据，通过ClinProTools软件的监督神经网络算法（SNN）模型算法构建感染布鲁氏菌疫苗株、野毒株血清的标准检测模型，并获得了用于鉴别布鲁氏菌疫苗株、野毒株感染血清的特征蛋白组合，所构建模型的识别能力为100%，交叉验证值为95.13%。利用标准检测模型对待测血清的MALDI-TOF MS质谱数据进行分类分析，可准确判断待检测血清是否为布鲁氏菌疫苗株感染或野毒株感染。本发明方法准确度高、重复性好，通量高，检测成本低廉，结果可靠，具有良好的应用前景。