本发明涉及分子生物学及临床检测技术领域，具体涉及基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用。本发明以rpoB基因第1296位碱基突变作为分子标记鉴别结核分枝杆菌复合群菌株，针对该位点以及rpoB的516位点、526位点和531位点氨基酸突变设计了特异性引物探针组，开发了基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的方法。本发明的引物探针组检测灵敏度高、特异性强；该方法对设备的依赖性低，检测耗时短，可实现快速、准确的检测，结合侧向流动试纸条可实现可视化检测，对结核分枝杆菌复合群菌株的感染检测及结核分枝杆菌耐药性检测具有重要的应用价值。