本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41及其制备方法和应用。该蛋白是新发现的、柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达的蛋白，是与子孢子入侵宿主细胞相关蛋白，该蛋白的氨基酸序列包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。将EtROP41基因与大肠杆菌表达载体相连获重组表达载体，在大肠杆菌中表达重组EtROP41蛋白，将重组蛋白纯化并与佐剂混合，制得鸡柔嫩艾美耳球虫ROP41重组蛋白疫苗，该疫苗免疫雏鸡后能有效抵抗柔嫩艾美耳球虫感染，提高雏鸡存活率、增高雏鸡的相对增重率、减少球虫卵囊排出量，是一种新的具有良好免疫保护效果的重组蛋白疫苗，具有作为预防鸡柔嫩艾美耳球虫病疫苗研发的潜力。