本发明公开了一种高准确度的5’-核苷酸酶测定试剂盒，涉及生物检测技术领域。所述的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2；试剂R1：N-乙酰哌嗪-N-2-乙磺酸、4-氨基安替比林、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶和叠氮钠；试剂R2：N-乙酰哌嗪-N-2-乙磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺、5’-次黄苷单磷酸盐、和叠氮钠，本发明在实施过程中通过控制各组分的质量比提高试剂盒的稳定性同时提高了检测准确度和精密度，并且该试剂盒适用于全自动生化分析仪，操作简单，自动化程度高，适合再临床上广泛应用。