本发明涉及一种Glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒，其包括已包被捕捉抗体的包被微孔板以及偶联有标记酶的血清抗体；所述捕捉抗体为1H5、2D12或3A6；所述血清抗体包括：抗GPC3-P1的血清抗体GPC3-S1、抗GPC3-P2的血清抗体GPC3-S2、抗GPC3-P3的血清抗体GPC3-S3或抗GPC3-P4的血清抗体GPC3-S4，所述GPC3-P1~GPC3-P4的氨基酸序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示；本发明还涉及利用上述检测试剂盒进行检测的方法。本发明具有检测方便、费用低且检测范围宽的优点。