本发明提供了一种香豆素衍生物Mito‑Cys及其制备方法和应用，所述香豆素衍生物，中文名称为(E)‑(3‑(4‑(3‑(7‑(二乙氨基)‑2‑氧代‑2H‑苯并吡喃‑3‑基)‑3‑氧代丙‑1‑烯‑1‑基)‑2‑甲氧基苯氧基)‑3‑氧丙基)三苯基季膦盐，英文名称为(E)‑(3‑(4‑(3‑(7‑(diethylamino)‑2‑oxo‑2H‑chromen‑3‑yl)‑3‑oxoprop‑1‑en‑1‑yl)‑2‑methoxyphenoxy)‑3‑oxopropyl)triphenylphosphonium，缩写为Mito‑Cys。本发明提供了一种对半胱氨酸特异性检测的方法，是基于香豆素衍生物Mito‑Cys，在磷酸缓冲溶液(pH 8.0)中检测半胱氨酸。本发明中Mito‑Cys可以对细胞线粒体中的半胱氨酸进行半定量地检测，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。