一种鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的PCR试剂盒及其使用方法，属于检测领域。该试剂盒包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、灭菌双蒸水、野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品组成，其中包括用于鉴定猪种1型菌株的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2，以及S2疫苗株和野毒株的特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4。该PCR试剂盒实用性强，成本低，耗时短，可重复性好，通过普通PCR扩增后，利用电泳检测扩增条带的大小，能够快速、有效、直观的鉴别样品中布鲁氏菌猪种S2疫苗株和其他种属野毒株，用于解决布鲁氏菌和防控过程中疫苗株和野毒株鉴别诊断的难题。