本发明提供了基于血清的布鲁氏菌疫苗株感染快速检测方法，涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明提供了用于鉴别布鲁氏菌疫苗株感染血清的特征蛋白组合，利用这些特征蛋白组合通过ClinProTools软件的GA模型算法构建疫苗株感染布鲁氏菌病血清的标准检测模型，所构建模型的识别能力为100％，交叉验证值为99.56％。利用标准检测模型对待测血清的MALDI-TOF MS质谱数据进行分类分析，可准确判断待检测血清是否为布鲁氏菌疫苗株感染。本发明方法适于布鲁氏菌疫苗株感染的高危人群的血清检测，准确度高、重复性好，通量高，4小时内可完成96个样本的检测，检测成本低廉，结果可靠，具有良好的应用前景。