本发明公开了一种合成β-法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明基因工程菌敲除了酿酒酵母中GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和HMG1基因，其中利用的启动子和终止子分别为PGAL1，PGAL10，PGAL4和TCYC1，TADH1。利用该基因工程菌的生物转化能力，结合玉米水解液为培养基，能够低成本、绿色、环保地生产β-法尼烯。利用本发明基因工程菌发酵，β-法尼烯的产量可达56mg/L。本发明基因工程菌以及合成β-法尼烯的方法适用于实际工业生产。