本发明提供一种从原油污染土壤中分离与纯化高效石油烃降解菌的方法，包括将无机盐培养基与高含油土壤样品混合培养，利用稀油/无机盐培养基对混合培养后的培养液进行驯化培养，再利用稠油/无机盐培养基对驯化培养后的培养液进行驯化培养，将所得培养液稀释后涂布于原油/无机盐固体平板培养基上并进行培养；再经纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株于牛肉膏蛋白胨培养基中进行培养，将所得菌液接种至原油/无机盐液体培养基中进行原油降解实验；测定该纯化菌株原油降解率，选择原油降解率较大的菌株。该方法可获得能具有广谱降解原油中各组分能力的石油烃降解菌，具有广泛的应用性及较高的使用价值。