本发明属于分子标记及其检测领域，具体涉及一种鉴定黄瓜种质真实性的核心SNP位点、引物组合，基于SNP位点的DNA指纹数据库、数据库构建方法，以及基于SNP位点的黄瓜种质真实性的鉴定方法、应用。所述SNP位点选自第一SNP位点到第四十八SNP位点中的任1到48种。本发明建立了基于高通量测序鉴定黄瓜种质真实性的DNA指纹数据库，可用于对黄瓜种质在种子、幼苗、叶片等组织或器官进行早期鉴定，为黄瓜种质资源保护提供技术支持。本发明提供的方法既可以对未知黄瓜种质进行鉴定，也可以对已知黄瓜种质的真实性进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等优点，具有十分广阔的应用前景。