本发明涉及生物检测领域，提供了一种抗MSH6蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明人还提供了抗MSH6蛋白单克隆抗体的制备方法，其免疫小鼠所用的抗原为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白。发明人还提供了一株分泌抗MSH6蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系AbM58060‑20A2‑PU，保藏号为：CGMCC NO.17492。抗MSH6蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达MSH6蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。