本发明公开了17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及工程菌，17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶简写为17β‑HSD3G186R/Y195W，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用理性设计技术对17β‑羟基类固醇羟化酶3进行分子改造，经多同源建模、分子对接、结合能计算等方法而获得与底物亲和力提高的17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶，酶活提高为原来的1.66倍，利用此策略可以显著提高17β‑羟基类固醇羟化酶3的催化活力。本发明的编码17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶使睾酮产量高达3.95g/L，为规模化的生物法制备睾酮这种雄性激素类药物提供技术支撑和数据参考。