本发明提供了一种利用斑马鱼卵黄延伸部长度评价环境污染物发育毒性的方法，属于环境检测技术及毒性研究技术领域。将发育至4～5hpf的斑马鱼胚胎暴露于环境污染物或对照培养液中，发育至60～84hpf时统计胚胎卵黄延伸部长度、卵黄延伸部长度与卵黄球及延伸部总长度的比值或卵黄延伸部长度与胚体长度的比值；当环境污染物组胚胎的卵黄延伸部长度、卵黄延伸部长度与卵黄球及延伸部总长度比值、卵黄延伸部长度与胚体长度比值和对照组相比，任一项出现显著差异时，表明所述环境污染物具有发育毒性。与卵黄球发育和胚体发育相比，卵黄延伸部发育所受环境污染物毒性更为敏感，可有效评价较低剂量环境污染物的发育迟缓毒性效应，同时所述方法操作简便快速、检测灵敏度高。