本发明的微生物目标片段中特异性区域的识别方法，包括步骤：S100，将微生物目标片段与一个或多个对比菌株全基因组序列分别进行一对一比对，去除相似性超过预设值的片段，获得若干剩余片段，作为第一轮切割片段T1～Tn；S200，将所述第一轮切割片段T1～Tn分别与其余对比菌株的全基因组序列比对，去除相似性超过预设值的片段，获得剩余切割片段的集合作为微生物目标片段的候选特异性区域；S300，验证和获得特异性区域。本发明准确性高；灵敏度高，可识别到亚种水平；具有双重验证模块，结果准确。有些rRNA基因同物种无法区分，并且不是所有质粒都有物种特异性，也不具有普遍性，本发明可以适用于任何病原体全基因组中识别特异性区域。