本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，公开了一种产L-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产L-乳酸的方法及应用，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于出发菌株，所述重组菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活且L-乳酸脱氢酶的活性增强；构建方法包括对出发菌株进行遗传改造以使出发菌株的D-乳酸脱氢酶的活性减弱或失活并使出发菌株的L-乳酸脱氢酶的活性增强；发酵产L-乳酸方法包括将上述重组菌株接种前述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至产酸发酵培养基中进行发酵；采用该方法显著提高了发酵效果、以及L-乳酸产率和和产物L-乳酸的光学纯度。