本发明公开了一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法，在PDMS微孔阵列芯片上设置直径为140‑160μm、深度为30‑50μm的圆柱形微孔，且任意相邻的两个微孔的圆心距离为250‑350μm；芯片经预处理后，将细菌密度为102‑104个/ml的样品溶液滴加芯片上，使样品溶液覆盖、填满所有微孔，倾斜芯片去除其表面残留的溶液；然后将芯片有微孔的一面倒扣在琼脂培养基上，进行细菌分离培养，最后揭除芯片进行挑菌鉴定。本发明方法可以一步地高效地分离样品溶液中的单细菌，避免了培养时的优势菌株干扰，适用于各类细菌分离培养，大大提高了细菌分离的效率，实现了高通量的单细菌分离。