本申请涉及一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用。本发明将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72基因插入经改造pFastBac‑Dual后获得的穿梭载体，制备重组穿梭质粒pF4‑pp62‑p54‑p30‑p72，并获得重组杆状病毒rBac‑pp62‑p54‑p30‑p72，实现昆虫细胞中的高效共表达。基于共表达的混合重组蛋白建立用于检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法，具有敏感性高、特异性高和重复性好等优点。