本发明公开了用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、H7亚型的引物组，包含马流感病毒H3亚型引物对和马流感病毒H7亚型引物对；其中，所述流感病毒H3亚型的引物对包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；所述马流感病毒H7亚型引物对包括SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。本发明还公开了包含上述引物组的用于二重PCR同时检测马流感病毒H3、H7亚型的试剂盒，在包括马流感病毒H3亚型引物对和马流感病毒H7亚型引物对的基础上，包含马流感病毒H3亚型探针和马流感病毒H7亚型探针。本发明提供的引物组和试剂盒可实现一管同时检测H3、H7两种亚型的病原，从而进行马流感亚型鉴别，其检测灵敏度高，特异性强，且相互之间不发生交叉反应。