本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法，该重组腺病毒感染细胞后可以同步表达非洲猪瘟p54、p30和E248R蛋白，其中p54和p30蛋白融合表达，E248R通过自裂解2A信号肽与p54和p30串联表达。本发明构建了能同时表达p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒载体，使用该载体与腺病毒骨架系统共转染细胞后获得可表达非洲猪瘟病毒p54、p30和E248R蛋白的重组腺病毒，使用该重组腺病毒免疫试验动物后可以刺激试验动物产生特异性的抗体，为非洲猪瘟疫苗的开发提供了新的试验数据。