本发明公开了一种局部微观结构可定量调控的三维凝胶的制备方法，包括如下步骤，S1、将凝胶主干大分子溶液分成主干大分子溶液第一部分和主干大分子溶液第二部分；S2、主干大分子溶液第一部分、主干大分子溶液第二部分分别与不同物质的量的粘附肽链混合并孵育使其接枝得到产物一、产物二；S3、分别在产物一、产物二中加入不同物质的量的位点封闭分子，得到具有不同量空置交联位点的产物三、产物四；S4、产物三和产物四室温孵育2‑10分钟，再混合得到混合物五；S5、将细胞悬液加入混合物五中，搅拌均匀得到含细胞的前体溶液；S6、在容器内底面添加交联分子溶液，然后将含细胞的前体溶液与交联分子溶液混合，得到交联密度、粘附肽链都非均匀的三维凝胶。