本发明提供了一种PCR仪的光路校准方法、装置及PCR仪，PCR仪包括具有M排N列孔位的样品板，孔位用于放置试管，每个孔位对应一个光路，其中，M≥2，N≥2，且M、N为整数；根据获取的本底信号值和测量的第一染料信号值计算M×N个孔位对应的第二染料信号值；根据第二染料信号值计算M×N个孔位对应的第一校准系数；获取第一多连管中每一个试管对应的第二校准系数；根据第一校准系数和第二校准系数计算得到M×N个孔位对应的目标校准系数。通过上述目标校准系数可以对PCR仪的多个孔位进行校准，以减小不同孔位对应的光路间的差异，使不同孔位对同一个信号检测时的信号强度保持一致，提高检测结果的精准性。