本发明属于生物技术与植物分子生物学领域，特别涉及一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用，为便于分离不用花生组织器官的原生质体，本发明根据花生组织细胞的特定结构，提供了一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，该方法是一种适用于分离不同花生组织细胞的通用方法，能够快速、高效地制备出不同花生组织器官的原生质体细胞，所分离得到的花生原生质体，不仅获得率高，而且细胞活性好，可应用于花生体细胞的融合，花生蛋白质瞬时表达系统的开发，花生单细胞的测序以及基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1的敲除靶点检测等花生分子生物学相关研究。