本发明公开了一种井冈霉素的分离纯化方法，所述分离纯化方法为：(1)将井冈霉素粗品溶于去离子水中，并采用盐酸调节pH至3.0‑4.2之间，得到井冈霉素水溶液；(2)采用两隔室电渗析装置，阳膜和阴膜采用合金离子交换膜，在淡水室通入步骤(1)获得的井冈霉素水溶液，浓水室通入纯水，启动电渗析装置进行分离纯化，使井冈霉素H留在淡水室，其他主要成分进入浓水室；(3)采用两隔室电渗析装置，阳膜和阴膜采用均相膜，在淡水室通入步骤(2)获得的浓水室溶液，浓水室通入纯水，启动电渗析装置进行分离纯化；(4)将步骤(3)处理得到的淡水室中物料进行喷雾干燥，获得井冈霉素。本发明方法收率高，产品纯度高，分离时间短，用水量大幅减少。