本发明属于光学分子影像技术领域，公开了一种基于多层感知网络的契伦科夫荧光断层成像重建方法，生成网格化后的样本模型，并生成训练样本；构建契伦科夫荧光断层成像的多层感知网络并进行训练，多层感知网络可以分为前向网络A和逆向网络B；采集生物体表面的契伦科夫荧光信号，重建得到生物体内部契伦科夫荧光光源三维分布信息；将得到的初步重建结果映射到构建的网格化后的样本模型中，再将其输入到多层感知网络，得到精确重建结果。本发明的方法得到的重建结果与真实光源从形状和位置上来说都更加接近，能够较为准确的重建出了契伦科夫荧光光源。