本发明涉及一种四环素发酵用混合氮源及其在四环素发酵中的应用方法，本发明将由豆粕粉、玉米胚芽粉、尿素、磷酸二氢钾和葡萄糖组成的混合物用乳酸杆菌发酵降解成混合氮源，作为四环素发酵基础料及补料的新型有机氮源使用，其中应用在发酵基础料中，能使发酵初级代谢达到一定的菌体量并维持良好的菌体质量；应用在补料中，可促进菌体由初级代谢进入次级代谢时的代谢产物合成，提高菌体产素能力；尤其是该新型混合氮源在发酵后期能够得到充分彻底利用，降低发酵结束时的物质残留，最终有效降低原材料成本，并缩短发酵周期，提高发酵效率。