本发明涉及2.5D孔隙结构微流体芯片及其制作和使用方法，2.5D孔隙结构微流体芯片包括上部图案层和下部水平基片层，所述上部图案层包括流体注入口、微流体芯片主体图案和排液口，所述微流体芯片主体图案包括桥体和多个间隔设置的圆柱区域，相邻的圆柱区域通过桥体连接，圆柱区域高度为30‑50μm，桥体高度为15‑25μm。本发明2.5D微流体芯片的圆柱区域和桥体错落设置，与传统2D微流体芯片相比，其内部通道是不均匀的，更为贴近真实自然界状况，所得试验数据更有代表性。本发明提出的2.5D孔隙结构微流体芯片的使用方法操作简便、极易上手且应用灵活，能够大幅缩短试验时间，快速分析出所需结果。