本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生产维生素B6的代谢工程菌株及其构建方法与应用。将自然界中不存在于同一生物体的两条从头合成维生素B6的途径有机整合到大肠杆菌中，同时敲除起桥梁作用的酶PdxH，形成两条并行的生物合成通道，通道一为内源途径，用来生产维生素B6的产品形式；通道二为外源途径用来生产维生素B6的活性形式以供细胞生命活动。所构建的工程菌株中进一步通过强启动子和/或优化RBS序列适度提高外源途径的表达，因而相对于原菌株具有相同的生长速率。本发明获得的工程菌株发酵生产维生素B6的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。